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盐渍青菜真菌菌群结构DGGE分析及酵母菌分离鉴定

来源:惠合发酵罐厂家 发布日期:2016-01-21 14:25:44作者:admin 点击次数:
    国内外学者对发酵蔬菜的微生物生态研究表明,乳酸菌、酵母菌是发酵蔬菜中的优势菌群,乳酸菌通过产酸降低 p H 值,抑制腐败微生物的生长,酵母菌在发酵过程中会产生乙醇、酯类等物质,可赋予发酵蔬菜良好的风味。张鹏、鄯晋晓、曾骏等开展了泡菜增香酵母菌的分离、鉴定及应用。罗松明等采用微生物培养技术对四川地区 16 份企业盐渍水样品微生态研究表明,大多数泡菜样品的酵母菌含量为 103~ 106CFU / m L。传统分离培养技术能获得的微生物仅占自然界微生物的 1% ~ 10% ,操作步骤繁琐,无法反映样品的真实菌群结构。变性梯度凝胶电 泳 技 术 ( denatured gradient gel electrophoresis,DGGE) 是一项研究微生物生态的现代分子生物学技术,1993 年由 Muyzer 等首次应用于微生生态学研究,不需培养分离微生物,直接提取样品 DNA,对目的片段扩增后电泳分析获得菌群结构信息。目前,该技术已广泛应用于土壤、海洋、胃肠道、菌肥、废水、污泥、发酵食品的菌群结构 研 究。1999 年,Ampe等首次采用 DGGE 技术研究食品菌群结构,随后许多科学家采用该技术对发酵面团、葡萄酒、香肠、韩国泡菜等发酵食品的菌群结构进行了研究。
    四川地区的盐渍青菜,俗称酸菜,是泡菜加工企业的主要产品之一,是以当地称为青菜的叶用芥菜( Brassica juncea) 盐渍使用发酵罐发酵而成的腌渍菜,是制作酸菜鱼底料、老坛酸菜方便面调味料、下饭菜及其他调味料、菜品的重要原料。与家庭统泡菜不同的是,为了达到长期贮藏蔬菜的目的,腌渍过程中的食盐添加量达 10% 左右。开展盐渍青菜微生物菌群结构研究,对生产管理、降低食盐用量、降低生产成本等具有指导意义。本文采用 DGGE 技术对取自生产车间的盐渍青菜的真菌群结构进行了解析,对分离培养得到的酵母菌进行了分子生物学鉴定,并对 2 种方法的实验结果进行了对比分析。
发酵罐成品图
发酵罐成品图
    1.  实验方法
    1. 1 盐渍青菜总 DNA 的提取
取盐渍青菜样品于冰袋表面解冻,用无菌研钵捣碎得 盐 渍 汁 液。取 汁 液 1m L 于 1. 5 m L 离 心 管,10 000 g 离心 5 min,去上清液,加入 500μL 裂解液( 100 mmol/L Tris-Cl,5 mmol/L EDTA,500 mmol/LNa Cl,1% SDS,p H 7. 5) 悬浮样品,在 - 20 ℃ 反复冻融3 次,加入 20μL 蛋白酶溶液( 20 mg / m L) 于 56 ℃ 水浴 60 min。向离心管中加入 200 μL 无水乙醇,混匀,用 UNIQ-10 核酸纯化柱套件纯化得总 DNA,置于 -20 ℃ 保存备用。
    1. 2 真菌 26S r DNA D2 区扩增
PCR 扩 增 引 物: 反 向 引 物 NL3A ( GAGAC-CGATAGCGAACAAG) 、正向引物 NL4A-GC ( CGCCC-GCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG-GGGTCCGTGTTTCAAGACGG) 均由上海生工合成,扩增目的片断大小为320bp。PCR 扩增体系为 50 μL,样品总 DNA4 μL,上游引物 NL4A-GC( 10 μmol/L) 和下游引物 NL3A( 10 μmol/L) 各 2 μL,2 × Taq PCRMaster Mix 25 μL,无菌超纯水 17 μL。PCR 扩增程序,94 ℃预变性 5 min,94 ℃ 变性 30 s60 ℃ 退火 40s,72 ℃ 延伸 1 min,30 个循环; 最后 72 ℃ 延伸 7 min。所得产物在 2% 的琼脂糖凝胶上电泳。
    1. 3 扩增产物的 DGGE 分析与测序
制备变性剂( 尿素与甲酰胺) 线性梯度 30% ~60% 的 8% ( W / V) 聚丙烯酰胺 ( 37. 5 ∶ 1,W / W) 凝胶,安装好仪器后,移取扩增产物 40 μL 于点样孔中。在温度为 60 ℃条件下,200 V 电泳 4 h,取出凝胶,用SYBER GREEN I 溶液染色 20 min,置于凝胶成像系统中拍照。在紫外防护下,将优势条带切割下来,送上海生工克隆测序,在 NCBI 网站利用 BLAST 比对鉴定。
    2.酵母菌分离与鉴定
    2. 1 酵母菌分离与形态观察
在无菌条件下取盐渍青菜研磨,取 5 m L 汁液于50 m L 的 MRS 液体培养基中,置于转速为 120 r / min、28 ℃ 恒温摇床中培养 24 h。用无菌生理盐水将富集培养 后 的 培 养 液 稀 释,得 10- 1、10- 2、10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、10- 7的不同梯度稀释液。分别取 10- 4、10- 5、10- 6、10- 7梯度稀释液各 0. 2 m L 涂布于 YPD固体平板培养基中,放于 30 ℃ 生化培养箱中培养24 h,每个梯度做 2 个平行。将其中具有典型酵母菌菌落特征的菌株挑出,在另一个 YPD 固体平板培养基上划线培养,镜检,反复 2 ~3 次,得到纯化的单菌落。
    2. 2 酵母菌的分子生物学鉴定
    2 2. 1 总 DNA 的提取
将酵母菌活化培养后,接种于液体培养基中,培养 16 ~ 24 h,吸取 1. 5 m L 菌液于 1. 5 m L 离心管中,采用 Ezup 柱式酵母基因组 DNA 抽提试剂盒提取总DNA,置于 - 20 ℃ 保存。
    2. 2. 2 18S r DNA 的扩增与测序
酵母菌 18S r DNA 的扩增反应体系为 50 μL,模板 DNA 4 μL,引物 EF3( 10 μmol/L) 、EF4( 10 μmol/L)各 2 μL,2 × Taq PCRMaster Mix 25 μL,无菌超纯水 17μL。PCR 扩增程序为 94 ℃ 预变性 5 min,94 ℃ 变性1 min,48 ℃ 退火 1min,72 ℃ 延伸 2 min,共 35 个循环; 最后 72 ℃ 延伸 10 min,4 ℃ 保存 10 min。通过1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物,将扩增成功的样品送上海生工测序,测序结果在 NCBI 网站进行比对分析。
    3. 系统发育树的构建
将所得的序列与数据库中已知序列进行比较,用Clustal 1. 83 和 MEGA5. 0 进行相似性分析及做系统发育树,bootstrap 为 1 000,建树类型为邻接法( neigh-bor-joining) 
    4、结论
    通过 PCR-DGGE 技术对真菌菌群结构分析表明,盐渍青菜的真菌基因多样性丰富,随着盐渍时间的延长,优势条带数量增多,盐渍 2 个月的青菜仅有1 条优势条带,真菌菌群结构与青菜原料相似,盐渍14 个月与 26 个月的青菜真菌菌群结构相似,并有 4条优势条带。通过序列分析表明,4 个优势条带分别与假丝酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属的菌株相似。从盐渍青菜样品中分离得到 10 株酵母菌,通过分子生物学鉴定为汉逊德巴利酵母、酿酒酵母、鲁氏接合酵母。PCR-DGGE 技术对盐渍青菜菌群结构的解析不依赖培养,方便简便快捷,获得的实验数据可靠,对生产具有较好的指导作用,是一种有效的研究手段。酵母菌在发酵蔬菜中具有促进香味物质生成、提高发酵蔬菜品质、抑制腐败等功能,可进一步开展发酵蔬菜专用酵母菌筛选、菌剂研发与应用等研究。
 

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