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乙醇胁迫对乳酸杆菌关键酶活力的影响

来源:惠合发酵罐厂家 发布日期:2016-01-26 14:27:49作者:admin 点击次数:
    乳酸菌( lactic acid bacteria,LAB) 是一类革兰氏染色呈阳性的杆菌或球菌,对葡萄糖发酵能产生50% 以上乳酸的一类微生物的总称。在乳酸菌中,乳酸杆菌是最大的一个属,是目前发酵产品市场中重要的发酵剂,也是一种颇受关注的益生菌,具有重要的经济价值。由于外界各种不良环境的胁迫及不利因素的影响,严重地限制了乳酸杆菌的生长及代谢能力,进而影响了益生功能的发挥,抑制了高效活性的利用。从生理或分子生物学的角度了解胁迫耐受性的机制是必要的,胁迫可定义为能引起生长速率或存活率降低的基因、蛋白或环境方面的一种变化。在实际应用过程中,菌体所经历的胁迫环境往往是复杂和交互的。发酵制品如酸马奶酒、葡萄酒、发酵乳饮料等都由乳酸菌与酵母菌共同在发酵罐中发酵而成,其发酵过程中所产生的代谢产物,造成生存环境不断地改变,菌体不可避免的受到各种胁迫条件的影响,如温度、p H、乙醇、渗透压等,其中乙醇是最常见的胁迫因子之一。
发酵罐成品图
发酵罐成品图

1 材料与方法
1. 1 原料面包乳杆菌 D2-5 和植物乳杆菌 D5-5 均来自石河子大学食品学院畜产实验室; 培养基 MRS; 考马斯亮蓝 G-250; 己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及ATP 酶试剂盒,均由南京建成生物公司提供; 无水乙醇及其他试剂,均为分析纯。
1. 2 主要仪器设备
紫外可见光分光光度计,郑州中谱仪器有限公司; 台式高速冷冻离心机,力康发展有限公司; 电子分析天平,上海第三天平仪器厂; 生物培养箱,上海精密誓言设备有限公司; 高压灭菌锅,上海申安医疗器械厂; 涡旋振荡器,金坛市医疗仪器厂; 超声破碎仪,南京舜玛仪器设备有限公司。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 不同乙醇体积分数胁迫对乳酸杆菌存活率的测定
收 集 对 数 生 长 末 期 的 菌 体,离 心 ( 4 ℃,10 000 r / min,5 min) 。细胞经 0. 85% 的生理盐水洗涤 2 次后重悬于等体积不同乙醇体积分数的 MRS 培养基中,胁迫 2 h。胁迫后的菌悬液经 0. 85% 的生理盐水洗涤 2 次后重悬于等体积生理盐水中,取 1 m L重悬液,稀释不同梯度涂布于平板上测定存活率。37℃ 下培养 24 h,实验重复 3 次,每次 3 个平行样品。存活率/% =NB/NA× 100式中: NA为未添加乙醇的活菌数; NB为不同乙醇体积分数胁迫后的活菌数。
1. 3. 2 己糖激酶( HK) 、丙酮酸激酶( PK) 、乳酸脱氢酶( LDH) 、ATP 酶的测定
1. 3. 2. 1 无细胞提取液的制备
菌体活化后,按 2% 的接种量分别接到体积分数为 5% 、8% 的乙醇液体培养基中培养,体积分数为离心( 4 ℃,4 000 r/min,10 min) 收集生长至对数末期的菌体,用无菌磷酸盐缓冲溶液( 0. 2 mol/L,p H 7. 4)或 0. 85% 生理盐水洗涤 2 次。取 4 m L 在冰水浴中进行超声破碎( 工作时间∶ 间歇时间 = 3s∶ 9s) ,持续 5min。离心( 4 ℃ ,6 000 r / min,10 min) ,取其上清液用于相关酶活性的测定。
1. 3. 2. 2 蛋白质的测定
考马斯亮蓝染色法。
1. 3. 2. 3 
相关酶活性的测定己糖激酶( HK) 、丙酮酸激酶( PK) 、乳酸脱氢酶( LDH) 、ATP 酶均采用南京建成生物公司相应的试剂盒进行测定。
1. 4 数据统计分析
采用 Excel 软件作图,SPSS 数据处理软件 One-way ANOVA 法对实验数据进行方差显著性分析,P <0. 05 为显著水平。

2 讨论
酵母进行乙醇发酵过程中,自身产生乙醇,达到一定浓度时,对酵母本身具有毒性,当然对与之相互作用的乳酸菌来说,更是不可避免。不同乙醇体积分数对菌体细胞损伤程度不同。乙醇胁迫可能同时作用或者连续作用,抑制菌体生长发酵能力,影响菌体的存活率,降低发酵效率。研究表明,不同菌株对乙醇的耐受性不同,菌株的乙醇耐受性与细胞膜的特性及内部环境有关。本文采用不同浓度对不同乳酸杆菌进行胁迫处理,结果表明 5% 乙醇胁迫处理有助于提高菌体存活率,但是效果不显著。在此胁迫过程中,乙醇可能促使细胞膜的通透性增大,物质代谢速率加快,反而会促进菌体生长,代谢酶活力提高。8% 乙醇胁迫处理后,存活率明显下降,菌体的生长受到严重抑制,致使相关酶活力降低。这一结果与李爱霞,陈伟帅,Graca da Silveira 等等研究结果一致,乙醇体积分数超过 8% ~ 10% 时,就会明显抑制乳酸菌的生长。乙醇作为有机溶剂具有亲水性的同时又涉及本身的固有毒性。研究发现,乙醇侵入细胞时,最先停留在细胞膜上,引起细胞膜表面性质的改变,如总能量的状态、主动运输系统及膜结构的变化等。同时乙醇具有很强的渗透能力,可以直接进入菌体内部,破坏蛋白质颗粒的水化膜,在等电点时使蛋白质沉淀,破坏了蛋白质构象,进而引起蛋白质变性。研究探讨的己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及 ATP 酶均属于蛋白酶,乙醇侵入会直接破坏蛋白质结构,导致酶蛋白变性,而使酶活力降低。乙醇对乳杆菌胁迫处理是一个比较复杂的过程,乙醇胁迫机理及菌体生长过程涉及影响因素颇多,进而乙醇胁迫对乳杆菌代谢活力的影响有待进一步探究。研究乳杆菌生长的过程中乙醇胁迫损失的关键因素,并采取有效可行的保护策略,为提高工业发酵过程中菌体存活率提供理论依据,更为工业化生产一体化奠定基础。

3 结论
( 1) 在乙醇胁迫处理过程中,5% 乙醇胁迫处理有助于提高菌体存活率,但是效果不显著。在 5% 乙醇胁迫条件下,面包乳杆菌 D2-5 与植物乳杆菌 D5-5存活率分别提高了 27. 11% 和 17. 20% 。
( 2) 8% 乙醇胁迫处理后,存活率明显下降,面包乳杆 菌 D2-5 与 植 物 乳 杆 菌 D5-5 仅 为 26. 61% 、23. 50% 。菌体的生长受到严重抑制,致使相关酶活力降低。
( 3) 乙醇胁迫处理对乳酸杆菌己糖激酶的影响不显著,而对丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及 ATP 酶具有显著或极显著性差异。这一结果说明,丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及 ATP 酶是乙醇胁迫影响菌体损失的关键酶,而酶活力的变化与菌体的活力相关。
 
 

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